НИТЧАТЫЕ АЗОТФИКСИРУЮЩИЕ ГЕТЕРОЦИСТНЫЕ ЦИАНОБАКТЕРИИ – ОБЪЕКТЫ ГЕНЕТИКИ, ГЕНОМИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИ.


Состав группы: главный научный сотрудник С.В.Шестаков, ведущие научные сотрудники Е.А.Карбышева, Л.Е.Михеева.


Коллекция штаммов нитчатых гетероцистных цианобактерий на кафедре составляет 21 штамм различного происхождения (пресные водоемы, почва рисовых полей, растения риса, симбиотические ассоциации с растениями). Три из них являются модельными объектами генетики цианобактерий: (Anabaena (Nostoc) varibilis ATCC29413, Nostoc sp. PCC7120, Nostoc punctiforme ATCC29133) с полностью секвенированными геномами размером от 7 до 9 Мпн.
Это грамотрицательные аэробные цианобактерии, способные к фиксации N2 и СО2 с использованием солнечной энергии и имеющие жизненный цикл, включающий несколько типов дифференцировки таллома: гетероцисты для N2-фиксации, акинеты (споры) для выживания и гормогонии для движения и создания симбиоза с растениями.
Штамм Anabaena varibilis ATCC 29413 более 40 лет интенсивно изучается во многих лабораториях мира с целью расшифровки механизмов азотфиксации, фотосинтеза, метаболизма водорода и дифференцировки (фото 1).

Фото 1. Клетки азотфиксирующей культуры Anabaena varibilis ATCC 29413.

В нашей лаборатории у штамма Anabaena varibilis ATCC 29413 с помощью химического мутагенеза были выделены уникальные мутанты (и эти работы подтверждены авторскими свидетельствами) с измененной регуляцией процессов азотфиксации и метаболизма водорода:

1). Дерепрессированные по нитрогеназе мутанты (устойчивые к аналогу аммония – этилендиамину) способны выделять в среду роста ионы аммония, образующиеся в результате азотфиксации, со скоростью 100 - 150 мк моль NH4+ / мг хлорофилла в час. В наших работах предложено использовать для иммобилизации цианобактерий алюмоборосиликатное волокно, что увеличивало выход аммония в несколько раз (Фото 2). Максимальная скорость фотовыделения NH4+ в периодическом реакторе для иммобилизованных культур составляет 300 мк моль NH4+ / мг хлорофилла в час.





Фото 2. Иммобилизованные на алюмоборосиликатном волокне (справа) дерепрессированные мутанты выделяют в 2-3 раза больше аммония, чем в суспензионной культуре (слева).

2). Штаммы, продуцирующие водород в аэробных и анаэробных условиях в результате снижения активности поглощающей гидрогеназы, которая в норме (в клетках дикого типа) рециклизует водород, образующийся в процессе азотфиксации (фото 3).



Фото 3. Тест на способность культур выделять водород в микроаэрофильных условиях (под шлифами в присутствии DCMU и фруктозы) показывает, что мутанты 17 и 84 выделяют в 3-4 раза больше водорода, чем исходный штамм дикого типа (w.t.). Иммобилизация культур также увеличивает выход водорода.

Фото 4. Метаболизм водорода у гетероцистных цианобактерий родов Anabaena и Nostoc   

В настоящее время проводится молекулярно-генетический анализ водород-продуцирующих мутантов для идентификации природы мутаций и разработки стратегии получения высокоэффективных штаммов-продуцентов биоводорода методами генной инженерии. Известно, что только зеленые водоросли и цианобактерии, обладающие оксигенным фотосинтезом, способны продуцировать водород за счет фотолиза воды.
С использованием методов биоинформатики и принципов системы GeneNet построена рабочая схема генной сети метаболизма водорода у гетероцистных цианобактерий родов Anabaena и Nostoc  (фото 4).

Используются современные биоинформационные подходы для анализа геномов модельных цианобактерий, для поиска консервативных, вариабильных, повторяющихся нуклеотидных последовательностей. На основе анализа инвертированных повторов в геноме Anabaena varibilis ATCC 29413 предложены новые праймеры для ПЦР - генотипирования ассоциативных и симбиотических штаммов Anabaena и Nostoc, что позволяет изучать генетическое разнообразие, эволюционные взаимосвязи, а также проводить скрининг природных штаммов, перспективных для фотобиотехнологии.



Основные публикации:

1. Михеева Л.Е.. Прямчук С.Д., Гоготов И.Н., Шестаков С.В. Дерепрессированные по нитрогеназе мутанты цианобактерии Anabaena azollae // Микробиология. 1990. 59(1):35-39.

2. Mikheeva L.E., Schmitz O., Shestakov S.V., Bothe H. Mutants of the cyanobacterium Anabaena variabilis altered in hydrogenase activity // Z.Naturforsh. 1995. V.50c. P.505-510

3. Boison G, Schmitz O, Mikheeva L, Shestakov S, Bothe H. Cloning, molecular analysis and insertional mutagenesis of the bidirectional hydrogenase genes from the cyanobacterium Anacystis nidulans // FEBS Lett. 1996. 394(2):153-8. PMID: 8843154

4. Galkin AN, Mikheeva LE, Shestakov SV. Insertional inactivation of genes encoding eukaryotic type serine/threonine protein kinases in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 // Mikrobiologiia. 2003. 72(1):64-9. PMID: 12698794

5. Шестаков С.В., Михеева Л.Е. Генетический контроль метаболизма водорода у цианобактерий // Генетика. 2006. Т. 42. №11. С. 1-14. PMID: 17163069

6. Л.Е. Михеева, Н.В. Белавина, Е.А. Карбышева, С.В. Шестаков. Молекулярно-генетический анализ новых штаммов Anabaena, выделенных из растительно-цианобактериального сообщества // Микробиология. 2010. 79(5):639–646.